干货分享|手把手教你做双荧光素酶实验

双荧光素酶检测是转录调控研究中十分重要的分子生物学技术，广泛应用于基因表达调控、非编码RNA靶向互作、信号通路激活验证等领域。在双荧光素酶检测中，将萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，F-Luc）作为实验报告基因，用于测试实验条件下基因的表达，海肾荧光素酶（Renilla Luciferase，R-Luc）作为内参基因，用于校正实验中的转染效率差异、细胞数量差异等。

一、 实验流程

双荧光素酶实验因为实验材料的不同可以分为动物双荧光实验和植物双荧光实验，在基本原理上相似，但在具体操作、实验目的和应用方面存在一些差异（图1） 。动物双荧光实验主要用于研究基因表达调控、信号转导途径等，在药物筛选、疾病诊断和治疗等方面具有潜在应用；植物双荧光实验在植物育种、遗传改良、生物活性评估等方面具有广泛应用。

图1 双荧光素酶实验流程

二、 具体步骤

1.载体选择与质粒构建

（1）载体的选择

a）两个萤光素酶基因（F-Luc和R-Luc）在一个载体上（推荐）

①pmirGLO载体

将两种荧光素酶基因引入同一个载体，以实现偏差小、转染易、细胞死亡率降低的目的。目前，最常用的是Promega公司研发的pmirGLO载体，以PGK中等强度启动子启动的萤火虫萤光素酶基因（luc2）为主报告基因，以海肾萤光素酶基因（hRluc-neo）作为内参报告基因，载体上带有抗性基因，可作为稳定转染筛选标记。

图2 pmirGLO载体图谱

②pGreenII 0800系列载体

         图3(1) pGreenII 0800-miRNA 载体图谱                                                                  图3(2)  pGreen II-0800-Luc载体图谱

b）两个荧光素酶基因（F-luc和R-Luc）分别在两个载体上

①pGL3系列载体

PGL3系列载体包括Promoter、Enhancer、Basic以及Control，都含有萤火虫荧光素酶报告基因，其中Control为对照载体；Basic仅含有一个Luc基因，无启动子与增强子；Promoter含有SV40启动子，可用于检测增强子；Enhancer则与之相反，即含有增强子，可用于检测启

②pRL系列载体

pRL系列载体为海肾荧光素酶报告载体，由Promega公司开发，其载体间最主要的区别是携带的启动子不同，包括CMV、SV40、TK等，即pRL-CMV、pRL-SV40、载体，将F-Luc载体与其共转染293细胞时，pRL系列载体起发挥内参作用。注：通常，内参基因表达的活性应当显著高于背景组，同时，尽量小，确保不干扰主报告基因的表达。因此，建议选择内参载体时，首先考虑活性较弱的TK启动子驱动的载体。当通过文献资料或者预实验，发现该载体在目标细胞模型中表达效率过低，或者会受到实验研究因素干扰时，再考虑其他表达活性更强的载体，或自己构建所需的特殊启动子载体。（详细图谱可网络自行检索）

（2）质粒构建

在载体构建过程中推荐使用无缝克隆方法，不受酶切位点的限制，且可以一次性实现多个片段的融合，操作简单，用时更短,阳性率高（产品推荐Cat：D0204P）

2.实验分组

a).miRNA-mRNA靶向作用验证（图4）

3’UTR是位于编码基因终止密码子下游延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端，通过自身结构或者与其他分子相互作用调控基因表达，miRNA大部分通过成熟体种子区与3’UTR结合抑制蛋白翻译。将待验证序列插入到报告基因载体的3’UTR区域，再共转入microRNA，如果荧光素酶表达下降，则待验证序列是miRNA靶序列。

b). 转录因子-启动子互作验证（图5）

转录因子(transcription factor，TF)也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。启动子能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性；将启动子区域序列插入到报告基因载体，同时在细胞实验中共表达转录因子，分析荧光素酶表达水平，反映转录因子是否通过与启动子结合影响基因表达情况。

图源：DOI：10.1093/hr/uhad130

3. 转染/注射

a）动物细胞

细胞转染：细胞融合率达到 90%时进行传代培养，细胞铺板：取对数生长期的细胞制成细胞悬液，计数，接种于 24-well /96-well培养板中（细胞数量，根据细胞形态和生长能力大小而定），在铺板细胞细胞融合度达到约 50% - 60%，即可根据实验分组进行质粒转染工作，按照转染试剂要求将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞（推荐Cat:T2123）。

b）植物组织

烟草注射：选取生长期4周左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射，避光24h，正常生长条件24-48 h。

4.细胞裂解及荧光检测（推荐Cat：DR075）

a)细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀后加入细胞内以充分裂解，离心 3-5 min，取上清加入萤火虫荧光素酶反应液，检测萤火虫荧光素发光，随后加入海肾荧光素酶反应液，检测腔肠素发光。

b)植物：取 3-4 片叶片研磨破碎后加入裂解液，冰上孵育5min后离心 1 min，取上清加入萤火虫荧光素酶反应液，检测萤火虫荧光素发光，随后加入海肾荧光素酶反应液，检测腔肠素发光。

5.数值分析

 在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的 F-Luc 值除以海肾萤光素酶测定得到的 R-Luc 值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。